在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當(dāng)。

  抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。

      這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

      溫育常采用的溫度有43 ℃、37 ℃、室溫和4 ℃（冰箱溫度）等。37 ℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37 ℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)ding峰。

       為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43 ℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4 ℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用。

      保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

      若用保溫箱，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。

      室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25 ℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。