ELISA試劑盒常用的方法
 

　　ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的簡稱，即酶聯(lián)免疫吸附測定，是研究蛋白抗體的重要方法。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶進行直接或間接結(jié)合，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進行定性和定量分析。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了該方法用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。我們一起聊聊常見的商業(yè)化ELISA試劑盒的方法種類以及它們各自的優(yōu)勢和用途：

　　睿創(chuàng)生物ELISA大致分為五種類型：直接法、間接法、競爭法、夾心法、捕獲包被法。在商品化試劑盒中用得比較多的是雙抗體夾心法、競爭法和間接法。

　　雙抗體夾心法是夾心法中的一種主要形式，我們先談?wù)剨A心法吧：

　　夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　　雙抗體夾心法中抗原的2個不同的抗原表位被兩個抗體-捕捉抗體和檢測抗體，分別結(jié)合。捕捉抗體固定于載體即酶標(biāo)板上，檢測抗體通過結(jié)合抗原進行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因為以多抗作為捕捉抗體容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)而降低特異性。檢測抗體通常為多抗，在商業(yè)化的科研試劑盒中經(jīng)常用到生物素標(biāo)記的山羊多抗，再讓生物素標(biāo)記的多抗與HRP標(biāo)記的親和素或者鏈霉親和素結(jié)合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應(yīng)顯色，這種方法是在傳統(tǒng)的HRP酶標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了生物素-親和素放大系統(tǒng)。

　　不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢，但該法只適用于有多個結(jié)合位點的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測細胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時會將樣本和酶標(biāo)抗體同時加入進行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因為操作時間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)(hook ffect)，因為此時如果樣本中抗原含量過高會導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無法形成“夾心復(fù)合物"，此時測出的結(jié)果將低于實際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。

　　雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，在醫(yī)學(xué)檢驗上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定，故此靈敏度相對而言高于我們隨后要說的間接法。

　　競爭法也是一種很常用的方法，一起看看：

　　競爭法(Competitive ELISA)是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競爭性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體(或抗原)濃度越高，則能與固定抗原(或抗體)結(jié)合的酶標(biāo)抗體(或抗原)就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對照相比，顯色越淺，表示檢測樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測也可用于檢測比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點，不適用于雙抗夾心法進行測定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣泛運用。

　　最-后再說說間接法，間接法(Indirect ELISA)只能用于測定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。間接法使用了二抗增加信號強度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

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